En abril de 1550 zarpó con embarcaciones, 250 hombres y alrededor de 50 mujeres; entre ellas, 20 “doncellas” destinadas a formar familias criollas en la nueva tierra.
El viaje fue muy duro: sufrieron ataques de piratas, brotes de viruela, deserciones y choques con pueblos locales, lo que causó muertos y retrasos. Doña Mencía pidió auxilio a los portugueses en la costa brasileña, pero ellos detuvieron temporalmente a ella y a su grupo. Finalmente, en julio de 1555 llegó una orden real que los liberó; al mismo tiempo, cartas oficiales reinstauraron como gobernador del Paraguay a Domingo Martínez de Irala, lo que dejó sin efecto los títulos reclamados por doña Mencía.
Una parte de la expedición fundó el fuerte de San Francisco de Mbiaza en la costa (uno de los pocos poblados en el litoral marítimo bajo la jurisdicción asuncena); luego, tras una penosa marcha por tierras difíciles y meses de sacrificio, la mayoría del grupo —sobre todo mujeres— llegó a la laguna Tapaycuá (Ypacaraí) y, finalmente, a Asunción en mayo de 1556.
Estas mujeres, en su mayoría de Extremadura, se casaron con los vecinos españoles de Asunción y ayudaron a forjar la base demográfica y cultural del Paraguay colonial.
Doña Mencía no solo quedó en la memoria por su liderazgo durante la travesía, sino también por sus ilustres descendientes. Entre ellos destacan Fernando de Trejo y Sanabria, que fue el primer obispo criollo y fundador de la Universidad de Córdoba; y Hernando Arias de Saavedra (Hernandarias), el primer gobernador criollo del Paraguay, cuya trayectoria al servicio de la Corona fue muy relevante en la formación del territorio colonial.